H2N2 流感病毒是 1957 年 “亚洲流感” 大流行的病原体，目前已从流行中消失。然而，H2 型流感病毒仍在禽类宿主中传播。再加上人类群体中针对 H2N2 的特异性免疫力逐渐减弱，H2N2 流感病毒存在再次传入人类群体的风险。疫苗有助于预防未来的大流行，但要评估其效力则需要动物模型。因此，我们着手扩展雪貂作为 H2N2 流感疾病模型的应用，通过鼻内或气管内接种四种不同的 H2N2 病毒来研究它们对疾病严重程度的影响。这些 H2N2 病毒是在大流行期间或 H2N2 流行接近尾声时收集的，涵盖了进化枝 I 和进化枝 II 的病毒。用不同病毒感染雪貂后发现，病毒的复制、疾病表现和病理特征在不同病毒分离株和感染途径之间存在显著差异。根据病毒分离株的不同，鼻内接种会引发从严重到轻微的鼻炎，且不会导致肺部感染或病理变化。当通过气管内接种时，能在下呼吸道成功复制的病毒分离株会引发一种非致命性疾病互联股票融资平台，类似于人类的中度肺炎。病毒之间在复制和致病方面的差异可能与其对 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸的结合偏好有关。本文提出的模型可有助于开发新一代的 H2N2 流感疫苗。
重要性：1957 年，世界遭受了由 H2N2 亚型甲型流感病毒引起的大流行。尽管该病毒在 1968 年消失了，但 H2 型病毒仍在禽类宿主中传播。因此，H2N2 流感病毒有可能再次传入人类群体，从而引发另一场大流行。通过接种疫苗可以减轻新的 H2N2 流感大流行的影响。然而，这些疫苗首先需要在动物模型中进行开发和测试。为此，我们扩展了雪貂模型，以模拟人类感染 H2N2 流感的不同方面和疾病表现。该模型可用于开发和评估新的 H2N2 流感疫苗。
展开剩余95%一、引言
1957 年，“亚洲流感” 成为 20 世纪的第二次流感大流行。此次大流行的病原体是 H2N2 甲型流感病毒，它是由禽流感的 H2、N2 和 PB1 基因与人类 H1N1 流感病毒基因片段重配产生的。该病毒迅速在缺乏免疫力的人群中传播，据估计在大流行期间导致了 100 万至 200 万人死亡。自出现后，H2N2 一直作为季节性流感病毒传播，直到 1968 年被 H3N2 取代。尽管它已经消失，但我们并不能免受其再次传入的威胁，因为基因相似的毒株仍在鸟类中传播，而且 1968 年以后出生的人不具备 H2 中和抗体。鉴于 H2N2 曾引发大流行的历史，现在由于人群中针对 H2N2 的体液免疫力正在迅速下降，这构成了一种风险。
血凝素（HA）的受体结合域发生的突变会影响其与细胞上受体的结合亲和力。禽源的 HA 蛋白更倾向于结合 α2,3 - 连接的唾液酸（SA），而人源适应性流感毒株的 HA 则偏好 α2,6-SA（参考文献 10 中有综述）。在从禽类宿主向人类宿主适应的过程中，结合偏好从 α2,3-SA 转变为 α2,6-SA 可能是禽源流感病毒适应的一个关键过程。不足为奇的是，大多数具有禽源 HA 的大流行性甲型流感病毒开始在人类中传播时，都具有对 α2,3-SA 和 α2,6-SA 的混合结合偏好（参考文献 11 中有综述）。这些毒株在人类群体中的持续传播导致它们对 α2,6-SA 的结合偏好逐渐增加。重要的是，α2,3-SA 主要存在于人类下呼吸道（LRT）的肺泡细胞上，而表达 α2,6-SA 的细胞主要存在于上呼吸道（URT；参考文献 10 中有综述）。上呼吸道感染通常仅表现为普通感冒症状，而下呼吸道感染则可能导致严重肺炎。因此，结合亲和力从 α2,3 - 向 α2,6-SA 的转变通常伴随着较低的疾病负担。因此，各个 H2N2 毒株的结合偏好也可能影响其致病机制。
鉴于下一次 H2N2 大流行的威胁，需要动物模型来评估 H2N2 疫苗。一般来说，雪貂被认为是研究流感防护的最佳小型动物模型，因为它在流感疾病方面与人类相似。这种相似性可能部分归因于 α2,6-SA 的分布，雪貂和人类的 α2,6-SA 分布相似。其他人已经表明，雪貂通过鼻内接种 H2N2 流感病毒会被有效感染，但尚未研究气管内接种对疾病和病理的影响。通过气管内接种将流感病毒输送到肺部，可以模拟更严重的流感疾病。我们通过鼻内或气管内接种不同的大流行和季节性人类 H2N2 病毒分离株感染雪貂，发现不同的 H2N2 分离株和感染途径在病毒复制和病理方面存在明显差异。重要的是，H2N2 分离株在病毒复制和病理方面的差异可能是由于它们对 α2,3 - 和 α2,6-SA 的结合偏好不同。
二、结果
01.HA 序列与 α2,3 - 或 α2,6 - 唾液酸的结合相关
我们选择了两株早期和两株晚期的人类 H2N2 病毒来感染雪貂（图 1A）。新加坡 / 1/57 株（Sin/57）和列宁格勒 / 134/57 株（Len/57）都是在 1957 年大流行期间分离出来的。加利福尼亚 / 1/66 株（Cal/66）和东京 / 3/67 株（Tok/67）是 H2N2 流行末期的季节性分离株，分别可归类为进化枝 I 和进化枝 II（4）。这些病毒在其 HA 序列上存在轻微的氨基酸差异，这可能会影响它们的结合和复制特性。因此，这些病毒在雪貂模型中可能会引发不同的病理变化。
图1. H2N2 毒株与 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸的结合。（A）人类和禽类 H2 序列的系统发育树。该树是基于 HA 蛋白序列通过最大似然法构建的。本研究中使用的四个人类 H2N2 分离株以粗体显示，GISAID 的 HA 蛋白标识符以灰色书写。比例尺表示遗传距离。（B）本研究中使用的四个人类 H2N2 流感病毒的 H2 与唾液酸（SA）结合相关的三个位点的氨基酸序列比对（21）。颜色根据 Clustal X 配色方案表示氨基酸谱的（保守性）。HA 序列根据 H3 编号显示（42）。（C）H2N2 病毒株与 α2,3 - 和 α2,6-SA 的结合情况，以及（D）通过生物层干涉法测定的 α2,6 - 与 α2,3-SA 之间的结合比率。由于列宁格勒株与 α2,6-SA 的结合为零，因此无法确定其比率。数据以平均值 ± 标准差表示，n = 3。使用单因素方差分析（1-way ANOVA）比较 C 和 D 图中病毒的结合率，然后进行 Tukey 多重比较检验。，P < 0.05；，P < 0.01；，P < 0.001；****，P < 0.0001。ns，无显著性差异。
HA 对唾液酸的结合偏好主要由 HA 的受体结合口袋决定，该口袋由 130 环、190 螺旋和 220 环组成（21）。我们对 H2N2 分离株的 HA 片段进行了测序，以研究它们的结合偏好。Len/57 的 HA 在 220 环（H3 编号；图 1B）中含有谷氨酰胺（Gln）226 和甘氨酸（Gly）228，这与禽源 H2 中发现的残基相对应。具有这些残基的 H2 HA 预计既能结合禽源型 α2,3-SA，也能结合人源型 α2,6-SA（21）。相比之下，Sin/57 和 Tok/67 可能更适应人类宿主，因为它们含有 Gln226 变为亮氨酸（Leu）和 Gly228 变为丝氨酸（Ser）的替换，已知这些替换会导致对 α2,6-SA 的强烈偏好性结合。虽然 Cal/66 与后两株分离株相似，也含有 Ser228，但它在第 226 位是苯丙氨酸（Phe）226，与它们不同。此外，这些病毒的 H2 HA 在 130 环和 190 螺旋上也存在一定程度的差异，这也可能影响受体结合的特异性和 / 或亲和力（图 1B）。
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由于结合偏好会显著影响病毒的复制，进而影响病理和疾病，我们着手通过生物层干涉法来确认并进一步分析所选病毒的预测结合特性。由于这种结合测定只能在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，我们使用了各自属于生物安全三级（BSL-3）分类的原始病毒的减毒重配疫苗病毒。对疫苗病毒的序列分析表明，与野生型病毒相比，虽然出现了一些突变，但这些突变都不存在于 HA 结合口袋中（表 1）。这四种病毒都能与 α2,3-SA 结合（图 1C），尽管它们在初始结合速率上存在一定程度的差异。除了具有禽源样 HA（Gln226/Gly228）的 Len/57 之外，大多数病毒也能与 α2,6-SA 结合（图 1C）。Sin/57 和 Tok/67 优先结合 α2,6-SA，这与它们的人源样 HA 特征（Leu226/Ser228；图 1D）一致。虽然 Cal/66（Phe226/Ser228）能够结合 α2,6-SA，但它更倾向于结合 α2,3-SA，就像 Len/57 一样，Len/57 对 α2,6-SA 没有任何结合。我们得出结论，不同病毒对唾液酸的结合偏好与基于第 226 和 228 位残基的预测偏好基本相符。有趣的是，尽管 Cal/66 病毒是在大流行开始多年后分离出来的，但它仍然更倾向于结合禽源型受体。需要注意的是，大多数（如果不是全部的话）H2N2 流感病毒分离株在首次分离时最初是在鸡胚上培养的，这可能会在 HA 结合结构域中引入某些突变，以便更有效地结合 α2,3-SA（22）。这也许可以解释为什么相对较晚的大流行株 Cal/66 病毒表现出对 α2,3-SA 的偏好，尽管这很难验证。
表1. 疫苗株 HA 与相应野生型病毒 HA 的突变情况。a. 本研究中用于雪貂感染的 BSL-3 病毒。b. 本研究中用于生物层干涉法的 BSL-2 病毒。c. 来自在线存储库的参考株（相同分离株或最密切相关的），用于与野生型病毒的内部 HA 序列结果进行比较。d. 仅可获得 HA 的部分参考序列。
我们还研究了本研究中使用的 H2N2 分离株的 HA 和 NA 蛋白序列是否与已知参考序列相同，因为多次传代可能会引入突变。在 NA 蛋白序列中未检测到差异，在 Sin/57、Len/57 和 Cal/66 的 HA 序列中存在少量氨基酸突变（Len/57 = 1；Cal/66 = 2）（表 1）。这些突变不存在于 HA 的受体结合口袋中，因此不太可能对与唾液酸的结合产生很大影响。对于 Tok/67，我们发现我们的病毒分离株与参考序列之间存在多个差异（表 1）。然而，根据蛋白质序列比对（blast），该参考序列与其他（晚期）H2N2 进化枝 II 序列不相似，也没有聚类在一起。相比之下，这里报道的 Tok/67 HA 蛋白序列与荷兰 / B2/1968 株有 99.12% 的相似性，并且与其他 H2N2 病毒聚类在一起（表 1 和图 1A）。因此，很可能是参考序列不正确，而我们在这里报道的 Tok/67 序列代表了晚期流行的进化枝 II 病毒，因为它与荷兰 / B2/1968 株有很高的相似性。
02.H2N2 分离株和感染途径之间的病毒复制和组织分布存在差异。
接下来，我们进行了一系列独立的动物实验，用四种 H2N2 病毒感染雪貂，并评估鼻内（i.n.）与气管内（i.t.）接种对病毒复制和病理的影响。我们首先用 H2N2 分离株 Sin/57 或 Tok/67 感染雪貂，并在感染后第 3、5 和 7 天（dpi）对动物实施安乐死，以确定病毒复制的动力学和病理发展情况（图 2A）。基于这些实验，我们发现感染后第 5 天能最好地评估病毒复制和病理情况。因此，随后用 Len/57 和 Cal/66 进行的实验仅在感染后第 5 天评估病理和病毒复制情况。
图2. 病毒组织分布和复制动力学取决于感染途径和病毒分离株。（A）4 至 8 个月大的雌性雪貂在第 0 天通过鼻内或气管内接种 10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）的流感病毒。然后在感染后第 3、5、7 天（Sin/57 和 Tok/67）或仅在第 5 天（Len/57 和 Cal/66）对动物实施安乐死，以研究病毒复制和病理情况。每个接种途径和解剖日 n = 3。Sin/57 和 Tok/67 的感染在单独的实验中进行，而 Len/57 和 Cal/66 的感染在一个实验中进行。（B，C）通过在 MDCK 细胞上进行 TCID50 测定来测量（B）鼻拭子和咽拭子以及（C）呼吸道组织中的病毒载量。虚线表示检测限。数据以（B）平均值 ± 标准差或（C）个体值表示，其中每个点代表一只雪貂。dpi = 感染后天数。“A” 图使用 BioRender 软件创建。
我们通过测定鼻拭子和咽拭子中的 TCID50 来测量呼吸道中的病毒复制情况。与之前关于其他 H2N2 流感病毒的报道类似（15，17），Sin/57 和 Tok/67 大约复制 6 天，因为大多数动物在感染后第 7 天检测为阴性（低于检测限）（图 2B）。鼻内感染 Sin/57 的动物在鼻腔中的病毒滴度明显高于气管内接种的雪貂，但在咽部未观察到这种差异。相比之下，气管内感染 Tok/67 的动物咽拭子中的病毒滴度较低，鼻拭子中的病毒滴度低于检测限。接种途径对 Len/57 和 Cal/66 感染的动物咽拭子中的病毒滴度没有影响，但鼻内感染 Cal/66 的雪貂从感染后第 3 天起鼻腔中的病毒滴度有所增加。重要的是，无论是鼻内还是气管内感染 Len/57 的动物，其鼻拭子中均未检测到有感染性的病毒。总之，除了 Len/57 之外，在我们研究的分离株中，鼻内感染的动物鼻腔中的病毒复制水平更高。Len/57 在鼻腔中复制效率低可能是由于其无法结合 α2,6-SA（图 1C）。除了 Tok/67 病毒外，鼻内和气管内感染的动物咽部的病毒复制情况相当。
为了更详细地研究上呼吸道（URT）和下呼吸道（LRT），我们在感染后第 3、5 和 7 天对鼻腔、气管和肺组织进行匀浆，并通过 TCID50 测定来确定病毒载量。与鼻拭子的结果一致，气管内感染的动物在鼻甲骨中检测到流感病毒的情况大多为阴性（图 2C）。然而，Cal/66 并非如此，因为在鼻内和气管内感染的动物的鼻甲骨和气管中都发现了病毒。对于其他病毒，气管中的病毒复制仅限于鼻内（Sin/57）或气管内（Tok/67）接种的雪貂。Len/57 几乎不在任何组织中复制，只有少数动物的病毒载量略高于检测水平。正如预期的那样，仅在气管内感染的动物肺部观察到病毒复制，这表明鼻内接种不足以在测试的 H2N2 病毒中建立下呼吸道感染。虽然 Sin/57 和 Tok/67 在气管内接种后能在肺部有效复制，但 Len/57 和 Cal/66 并非如此。
03.病毒分离株和接种途径之间的发热和体重减轻情况存在差异。
我们观察到的临床症状通常较轻，只有少数感染 Sin/57 的动物表现出活动轻微减少和呼吸困难加重。感染其他病毒分离株时未观察到明显的临床症状。我们还测量了发热情况，因为这是评估疾病严重程度的一个客观指标。一般来说，下呼吸道感染更为严重（18 - 20），这可能会影响发热的持续时间或热度。Tok/67 和 Sin/57 都能在下呼吸道复制，并且气管内感染导致发热更早出现（图 3A）。特别是在 Sin/57 感染的情况下，气管内感染的动物发热持续时间更长。感染 Cal/66 引发了轻微发热，但鼻内和气管内感染的动物之间没有明显差异。这与观察到的病毒复制局限于上呼吸道且未能建立下呼吸道感染的情况一致（图 2B）。感染 Len/57 的动物无论感染途径如何都没有出现发热，这也与未建立感染的情况相符。
图3. 发热和体重减轻取决于病毒分离株和感染途径。（A）通过腹部应答器每隔 30 分钟测量一次体温。数据以与基线的偏差（ΔT）表示，线条表示每组的平均值。（B）图 “A” 中感染后 5 天（dpi）内的数据曲线下面积（AUC）。低于基线 2 倍标准差以上的体温被排除在外，因为这些情况通常是由于麻醉引起的。数据以平均值 ± 标准差和个体值（黑点）表示。Sin/57 组 n = 8 - 9；Tok/67 组 n = 4；Len/57 组 n = 2；Cal/66 组 n = 2 - 3。（C）感染期间的体重相对于感染当天的体重。数据以平均值 ± 标准差表示，Sin/57 和 Tok/67 组 n = 3 - 6；Len/57 和 Cal/66 组 n = 3。
曲线下面积（AUC）—— 它是在一定时间范围内发热发作总和的衍生值 —— 证实了对于优先结合 α2,6 的病毒 Sin/57 和 Tok/67，气管内接种会引发更严重的发热（图 3B）。Cal/66 或 Len/57 则并非如此。这些发现得到了体重数据的支持。对于 Len/57 和 Cal/66 病毒，鼻内和气管内感染导致的体重下降情况相似（图 3C）。相比之下，当通过气管内接种时，Tok/67 和 Sin/57 感染导致体重下降更为严重，尽管组内差异相对较大。与 Tok/67 感染相比，Sin/57 感染导致的体重减轻更为明显。
04.呼吸道的病理情况受接种途径和病毒分离株的影响。
我们观察到病毒分离株和感染途径影响了病毒复制的部位和临床疾病。为了确定这是否也会导致病理异常方面的差异，我们在感染后第 5 天分析了鼻甲骨和肺组织的苏木精 - 伊红染色切片。鼻甲骨中评分的不同病理参数被汇总为最终的病理严重程度评分，评分范围为 0 - 5 分。正如预期的那样，鼻内接种的雪貂鼻甲骨受到的影响更严重（评分为 1 - 5 分），而气管内感染的动物病理情况不存在或轻微（评分为 0 - 1 分；图 4A 和 B）。鼻内感染导致鼻甲骨和上颌甲骨出现异常，而筛骨（嗅觉）甲骨在很大程度上未受影响。在感染后第 5 天，鼻内接种 Sin/57 的雪貂出现严重鼻炎，伴有杯状细胞肥大、假复层鳞状上皮以及严重的（黏膜下）炎症。综合起来，病理评分为 5 分。Tok/67 感染较轻，表现为轻度至中度鼻炎和黏膜下轻微炎症。呼吸道上皮在较大面积上受到中度影响，出现肥大和纤毛缺失，最高评分为 3 分。鼻内感染 Cal/66 的雪貂评分为 2 - 3 分，呼吸道上皮表面出现异常，从黏膜的轻微干扰到上皮衬里的假脱落不等。黏膜下存在炎症和充血。与其他三种病毒不同，Len/57 在雪貂中不会引起太多病理变化。仅观察到（黏膜下）黏膜的轻微干扰和炎症，在鼻内和气管内感染 Len/57 的雪貂中最高评分为 1 分。
图4. 呼吸道的病理情况由病毒分离株和接种途径决定。（A）不同病理严重程度的代表性鼻甲骨切片的苏木精 - 伊红染色，放大倍数为 ×100。比例尺表示 50μm。（B）感染后 5 天（dpi）鼻甲骨的病理总结评分（评分范围 0 - 5 分）。（C）不同病理严重程度的代表性肺切片的苏木精 - 伊红染色，放大倍数为 ×50。比例尺表示 200μm。（D）感染后 5 天（dpi）肺不同节段的损伤和炎症参数的病理评分（评分范围 0 - 5 分）。（E）D 图中评分的受病理影响的肺组织百分比。（F）感染后的肺重量相对于感染当天的体重。数据以个体值（A，C - E）表示，平均值 ± 标准差（仅 D 和 E）。所有图 n = 3，E 图中 Sin/57 组除外（n = 2 - 3）。
在肺部，感染引发了轻度至中度的多灶性支气管间质性肺炎，其严重程度取决于感染途径和病毒分离株。在各个组中观察到的主要病理特征是终末细支气管和呼吸性细支气管周围的多灶性炎症（细支气管周围炎），评分范围为 0 - 5 分中的 0 - 3 分（图 4C）。炎症包括淋巴细胞、巨噬细胞和多形核细胞。在某些情况下，细支气管管腔内充满了单核细胞和多形核细胞浸润以及一些坏死的细胞碎片，但并未阻塞。细支气管上皮衬里的干扰仅限于轻度至中度的肥大和增生。偶尔会观察到细支气管上皮坏死、间质炎症和肺泡间隔充血。有时会出现肺泡炎、肺泡出血和血管周围炎。支气管中偶尔会出现异常，而支气管本身未受影响。
对多个肺节段的损伤和炎症相关病理参数进行评分，评分范围为 0 - 5 分。感染途径和病毒之间的差异在细支气管的损伤和炎症方面最为明显（图 4D）。正如预期的那样，气管内接种后肺部病理情况更为严重，尤其是 Sin/57 和 Tok/67 的情况。在感染Len/57 和 Cal/66 的动物的支气管和细支气管中几乎未检测到异常，这反映了这些病毒在下呼吸道中没有临床疾病和病毒复制。对于除 Len/57 之外的所有病毒分离株，我们观察到一种趋势，即气管内接种导致受影响的肺组织百分比更高（图 4E）。我们还测定了 H2N2 感染后肺重量与体重的相对比值，作为对组织炎症和水肿形成的客观分析。相对肺重量的增加证实，与鼻内接种相比，气管内感染会导致更严重的下呼吸道病理变化（图 4F）。正如预期的那样，Len/57 并非如此，因为它在下呼吸道中不复制。
三、讨论
在此，我们报告了为评估疫苗而扩展雪貂作为 H2N2 流感感染和疾病模型的相关研究工作。在我们研究的四种病毒中，感染两株均优先结合 α2,6 - 唾液酸的病毒（Sin/57 和 Tok/67）会导致持续的高病毒复制水平和疾病症状。相比之下，Cal/66 的复制局限于上呼吸道，仅引发轻微疾病。Len/57 感染几乎不引发疾病，这反映出未建立起有效的感染。Sin/57 和 Tok/67 的复制部位明显由接种途径决定，因为沉积在下呼吸道的病毒不会感染上呼吸道，反之亦然。这与 Cal/66 不同，对于 Cal/66，无论是上呼吸道还是下呼吸道接种，都仅导致其在上呼吸道复制。因此，对于两株病毒，复制部位由接种途径决定，而对于另一株病毒，其结合偏好可能将复制限制在了上呼吸道。复制部位也影响了疾病的严重程度，因为与鼻内接种相比，通过气管内接种导致的下呼吸道感染会引发更严重的临床疾病和病理变化。
在我们测试的四种 H2N2 病毒中，所有对雪貂的感染都未导致死亡，这与其他（季节性）人类 H1N1 和 H3N2 病毒的情况类似。相比之下，感染禽源的 H5N1 和 H7N9 分离株（取决于毒株和接种途径）会导致雪貂死亡。在这个 H2N2 流感雪貂模型中未出现死亡情况，这反映了 H2N2 大流行期间人类的情况，与 1918 年大流行或 H5N1 和 H7N9 的人畜共患感染相比，H2N2 大流行并非极其致命。早期报告表明，大流行性 H2N2 疾病的临床症状与普通季节性流感没有太大差异。最重要的是，大多数 H2N2 大流行导致的死亡发生在非常年幼、非常年老或患有合并症的人群中。因此，对 H2N2 感染最准确的模拟应该表现为一种轻微的、非致命性的疾病。从这个角度来看，用 H2N2 病毒对雪貂进行鼻内和气管内接种都能准确模拟人类的 H2N2 感染。
很难将 H2N2 流感雪貂模型中的病理情况与人类病例进行比较，因为病理报告仅记录了致命的 H2N2 病例。然而，基于这些报告我们发现，雪貂的病理特征与人类病例相似，尽管程度较轻。在人类和雪貂中，H2N2 感染都可能导致多灶性肺炎。雪貂会出现充血现象，但在人类中似乎更为严重。细支气管的上皮衬里在人类和雪貂中都会受损，不过对于雪貂而言，受损迹象仅限于肥大和增生。严重充血、肺泡出血和毛细血管血栓形成是致命感染的标志，且仅在人类病例中观察到。雪貂的（病理严重程度）明显受到接种途径的影响。一般来说，鼻内接种引发的轻微疾病代表了典型的季节性感染，而气管内接种则引发中度肺炎。这主要体现在 Sin/57 和 Tok/67 这两株病毒上，它们在上呼吸道和下呼吸道都能有效复制。Cal/66 也有类似的病理情况，但程度较轻。相比之下，Len/57 在下呼吸道的复制水平低于检测限，与鼻内接种的情况类似；气管内接种不会引发疾病或病理变化。
我们和其他研究小组之前都曾用 H2 流感病毒感染过雪貂。在之前的一项研究中，我们仅通过鼻内途径用 Cal/66 或 Tok/67 感染雪貂。对于这两株病毒，雪貂在咽部和鼻甲骨中都表现出较强的病毒复制能力。尽管在这项研究中，感染 Cal/66 似乎比感染 Tok/67 引发的发热稍微严重一些，但感染病毒的雪貂鼻甲骨的病理评分在不同病毒分离株之间相似，且与我们在此报告的结果相当。研究人员们通过鼻内接种雪貂，发现所研究的所有病毒无论鼻内接种与否，都能在鼻甲骨和肺部复制。这不太可能是由于接种体积的差异导致的，但更高的感染剂量可能起到了一定作用。虽然研究人员们使用的感染剂量比我们高（10⁷半数组织培养感染剂量（TCID50）对比我们的 10⁶ TCID50），但他们的接种体积更小（0.2 mL 对比我们的 0.5 mL）。同样，研究人员们已经表明，以 0.5 mL 的体积用 10⁶ TCID50 的 H1N1 或 H3N2 流感病毒进行鼻内接种足以将病毒引入肺部。或者，研究人员们测试的病毒分离株可能具有不同的唾液酸结合偏好，又或者这些病毒受接种途径的限制较小。研究人员们表明，偏好 α2,3 - 唾液酸的 H2N2 病毒在雪貂中的传播效率较低。对于其中一株病毒，在感染的雪貂中自然发生了谷氨酰胺（Gln）226 变为亮氨酸（Leu）的替换。这种突变与对 α2,6 - 唾液酸的结合亲和力增强有关，并显著提高了病毒在雪貂之间的传播效率。这很可能是由于 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸在雪貂呼吸道中的分布情况直接导致的，在雪貂呼吸道中，α2,6 - 唾液酸在整个呼吸道中表达更为丰富。这些研究以及我们的结合分析结果，在一定程度上解释了为什么结合 α2,3 - 唾液酸的 Len/57 在雪貂中几乎不复制，也不会引起可观察到的疾病和病理变化。同样，偏好 α2,6 - 唾液酸的 Sin/57 和 Tok/67 能够轻易感染雪貂的呼吸道，导致高病毒滴度和随之而来的病理变化。Cal/66 偏好 α2,3 - 唾液酸，但也仍然能够结合 α2,6 - 唾液酸。尽管如此，与偏好 α2,6 - 唾液酸的病毒相比，Cal/66 在肺部的复制水平大大降低。有可能是 Cal/66 已经适应了在上呼吸道较低温度下的复制，这限制了它在温度较高的下呼吸道中的复制。需要更多的研究来阐明这种复制差异的分子基础。
病毒复制、疾病和组织病理学因接种途径和病毒的不同而有所差异。显然，由于 Len/57 缺乏有效的病毒复制和疾病表现，不适合作为雪貂 H2N2 疾病的模型。相比之下，Cal/66 确实能够复制并引发轻微疾病，尽管它无法感染下呼吸道。对于未来的雪貂模型，我们更倾向于使用 Sin/57 或 Tok/67。这两株病毒都能在上呼吸道和下呼吸道复制，且受接种途径的限制，这可用于调整疾病的严重程度。气管内接种引发的下呼吸道感染往往比鼻内接种引发的上呼吸道感染更为严重。在我们看来，因此对于评估疾病严重程度的疫苗攻毒模型，气管内接种更为合适，而鼻内接种则更适合评估疫苗诱导的免疫对减少病毒传播的作用。
通过本文所呈现的研究，我们表明雪貂是模拟人类 H2N2 流感的一个具有代表性的模型。感染途径和毒株的选择可以改变所引发的疾病严重程度和病理情况，使我们能够模拟轻度和中度的 H2N2 疾病。再结合研究雪貂细胞免疫和体液免疫的工具及试剂的开发，我们现在拥有了一个可行的模型，用于在预防流感感染的背景下研究疫苗诱导的免疫反应。这些进展能够进一步推动对新型、改良流感疫苗的研究。
四、材料与方法
01. 伦理声明
所有动物实验均已获得普纳瓦拉科学园动物研究中心动物福利机构的批准，批准许可编号为荷兰中央动物实验委员会的 AVD3260020184765。所有实验程序均依据欧盟法规开展。每天检查动物的总体健康状况，感染后每天对雪貂的活动情况和呼吸障碍程度进行评分。活动情况采用以下评分系统：0 = 活跃；1 = 受到刺激时活跃；2 = 不活跃；3 = 嗜睡；呼吸窘迫情况评分：0 = 呼吸正常；1 = 呼吸急促；2 = 呼吸沉重且为腹式呼吸。如果动物在预定结束时间之前，根据规定的终点标准（嗜睡或呼吸沉重、不活跃或体重减轻超过 20%）表现出严重疾病症状，将在使用氯胺酮（5 毫克 / 千克）和右美托咪定（0.1 毫克 / 千克）麻醉的情况下，通过心脏放血实施安乐死。
02. 病毒
从流感毒株储存库中获取了在鸡胚中培养的野生型 H2N2 流感病毒（包括四株病毒），其传代历史未知。减毒活 H2N2 病毒，某重配病毒。所有涉及野生型 H2N2 病毒的实验均在生物安全三级（BSL-3）条件下进行。流感病毒在添加了 40 微克 / 毫升庆大霉素、0.01M 甘油磷酸胆碱和 2 微克 / 毫升经 TPCK 处理的胰蛋白酶的 MEM 培养基中的 MDCK 细胞上进行培养。当细胞病变效应（CPE）超过 90% 时，收集细胞悬液并离心（4000×g，10 分钟）以去除细胞碎片，然后储存在–80°C 环境中。减毒重配病毒的 HA 序列进行测序，序列已存入全球流感序列数据库（GISAID）（标识符见表 1）。
03. 病毒测序与比对
使用特定引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增 H2N2 流感病毒的 HA 和 NA 片段。使用某测序仪进行测序，序列数据使用内部流程进行分析。从全球流感序列数据库（GISAID）和基因库（GenBank）中提取野生型人类和禽类流感病毒分离株的 HA 序列（标识符见图 1A）。使用 MEGA11 软件通过 MUSCLE 算法对野生型和重配的 H2N2 病毒序列进行比对。使用某软件根据 Clustal X 配色方案对已比对的野生型人类 H2N2 病毒进行颜色编码。这些 HA 序列根据 H3 编号显示。使用禽类和人类野生型 H2N2 病毒的 HA 蛋白序列在 MEGA11 软件中构建最大似然系统发育树。对于系统发育树中描绘的所有病毒，除了两株病毒（其没有完整的 HA 序列存入数据库）外，HA 蛋白序列均来自全球流感序列数据库（GISAID），本文中使用的是这两株病毒报道的全长 HA 序列。
04. 动物处理
提供的 4 至 8 个月大的雌性雪貂，需检测其先前是否感染过流感和阿留申病，仅选择检测结果为阴性的动物。雪貂到达动物设施后，根据体重进行分组，并以组为单位饲养在开放式笼子中。从感染那一刻起，所有操作均在经过 BSL-3 认证的隔离器中进行。在实验开始前 14 天，将 “DST micro T” 温度应答器（冰岛加尔扎拜尔的 Star-Oddi 公司）植入雪貂腹部，以测量体温。进行此操作时，使用氯胺酮（5 毫克 / 千克）和右美托咪定（0.1 毫克 / 千克）对动物进行麻醉。术后使用某药物（0.2 毫升）作为镇痛剂。使用阿替美唑（0.25 毫克 / 千克）拮抗右美托咪定的麻醉作用。采血和感染操作使用相同的麻醉剂，但对于感染操作，阿替美唑的使用延迟 30 分钟，以避免因打喷嚏和咳嗽而排出接种物。在没有其他处理（如感染 / 采血）的日子里，仅使用氯胺酮麻醉雪貂后进行体重测定和拭子采集。雪貂可自由进食和饮水。在预定结束实验时，使用氯胺酮和右美托咪定麻醉雪貂，然后通过心脏放血进行安乐死。
05. 研究设计
此处呈现的数据来自三个独立的雪貂实验（1 = 某株病毒；2 = 某株病毒；3 = 某两株病毒）。在每个实验中，雪貂通过鼻内（0.5 毫升）或气管内（3 毫升）接种 10⁶半数组织培养感染剂量（TCID50）的四种选定 H2N2 流感病毒中的一种。在感染某两株病毒后的第 3 天、第 5 天和第 7 天，处死动物以研究病理和病毒学情况。对于感染某两株病毒的实验，仅在感染后第 5 天将动物安乐死。每个条件（感染途径和实验结束日）下的组均包含三只动物。
在感染后的第 2 天、第 3 天和第 5 天，采集鼻拭子和咽拭子并测量体重。对于感染某两株病毒的情况，在感染后的第 1 天、第 4 天、第 6 天和第 7 天额外采集拭子并测量体重。鼻拭子和咽拭子采集到含有 15% 蔗糖、2.5 微克 / 毫升两性霉素 B、100 单位 / 毫升青霉素、100 微克 / 毫升链霉素和 250 微克 / 毫升庆大霉素的 2 毫升运输培养基中，并储存在–80°C 环境中。在预定的时间点，按照之前描述的方法对动物进行解剖。简而言之，使用（氯胺酮和右美托咪定）麻醉动物并使其放血，然后夹住气管，分离充气的肺部，称重并检查大体病理情况。分离气管中段（约 1 厘米）、右肺三个肺叶和副叶沿近端到远端轴的切片（约 1 厘米 ×3 毫米）以及右侧鼻甲骨，并储存在裂解基质 A 管中，于–80°C 保存，以便后续进行病毒学分析。将左肺头叶和尾叶以及左侧鼻甲骨固定在 10% 缓冲福尔马林中用于组织病理学分析。
06. 动物体温、体重和肺重量
从植入的温度记录仪中获取温度数据，数据为每 30 分钟测量一次的结果。基线温度计算为感染前 4 天的平均温度。温度变化计算为与基线的偏差（ΔT）。曲线下面积（AUC）计算为直到感染后第 5 天的总 ΔT。小于 “基线–基线标准差的 2 倍” 的值被排除，因为这些值通常是由麻醉引起的。相对体重和相对肺重量表示为感染当天体重的百分比或比例。
07. 病毒定量
将解冻的肺、气管和鼻甲骨样本在裂解基质 A 管中使用 FastPrep进行匀浆，然后以 4000×g 离心 5 分钟进行澄清处理。将鼻拭子和咽拭子解冻并涡旋振荡。所有用于病毒定量的样本进行连续稀释，并在感染培养基（MEM + 40 微克 / 毫升庆大霉素、0.01M 甘油磷酸胆碱和 2 微克 / 毫升经 TPCK 处理的胰蛋白酶）中的 MDCK 细胞上进行六次重复测试。培养 6 天后对细胞病变效应（CPE）进行评分，并使用 Reed–Muench 方法计算半数组织培养感染剂量（TCID50）值。
08. 病理
按照之前描述的方法进行病理评分。简而言之，将左肺头叶和尾叶用 10% 甲醛充气并储存。固定后，将肺叶包埋在石蜡中并切成 5 微米厚的切片。切片用苏木精和伊红染色，并在 ×50 或 ×100 放大倍数下进行显微镜检查。对于每个肺叶，至少对 6 个显微镜视野进行评分。病理评分区分 “上皮损伤” 和 “炎症” 类别。与损伤相关的参数包括肥大、增生、扁平或假复层鳞状上皮、支气管（细支气管）上皮坏死和剥脱、隔膜充血以及肺泡气肿和出血。与炎症相关的参数包括（细）支气管炎、间质浸润、肺泡炎以及以多形核（PMN）细胞、巨噬细胞和淋巴细胞浸润为特征的（血管周围）血管炎。病理结果按 0（无异常）到 5（严重损伤）的等级进行评分，并汇总为 “上皮损伤” 和 “炎症” 两个类别的 “最终评分”。在 ×20 放大倍数下估计受影响肺组织的百分比。
鼻甲骨的固定和染色方法与肺组织类似，并按照之前报道的方法进行分析。对切片进行显微镜检查，并根据不同组织病理学参数对组织的影响严重程度和百分比确定一个总结评分（范围为 0–5）。组织病理学参数包括上皮衬里的损伤、炎性细胞的存在以及渗出物和 / 或出血的存在。所有显微镜切片进行随机排列并盲法评分。
09. 受体结合
使用 Octet RED348通过生物层干涉法分析 H2N2 病毒的结合活性，方法与之前描述的类似。简而言之，将链霉亲和素传感器用生物素化的合成聚糖 2,3 - 唾液酸基 - N - 乙酰乳糖胺 - N - 乙酰乳糖胺（3’SLNLN，称为 α2,3 - 唾液酸）或 2,6 - 唾液酸基 - N - 乙酰乳糖胺 - N - 乙酰乳糖胺（6’SLNLN，称为 α2,6 - 唾液酸）饱和加载。合成聚糖由荷兰乌得勒支大学化学生物学与药物发现系合成。随后，在存在 NA 抑制剂奥司他韦羧酸盐（OC）的情况下，将传感器移至含有病毒的孔中 15–30 分钟，以获得病毒结合曲线，如之前所述，该曲线用于确定病毒初始结合速率（指 vobs = dB/dT，单位为纳米 / 分钟）。所有实验均在含有钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于 30°C 下进行，传感器以 1000 转 / 分钟的速度振荡。初始结合速率根据病毒颗粒数量进行归一化处理，病毒颗粒数量通过使用 NanoSight NS300 仪器进行纳米颗粒跟踪分析来确定，方法如之前所述。病毒制剂用超纯磷酸盐缓冲液（PBS）预稀释，以达到适合用纳米颗粒跟踪分析（NTA）进行分析的浓度。所有测量均在 19°C 下进行。NanoSight NS300 每次分析记录五个 60 秒的样本视频，然后使用纳米颗粒跟踪分析 3.0 软件进行分析，生成关于颗粒数量的定量信息。颗粒数量用于确定每个颗粒的初始结合速率。
10. 数据分析、统计检验和数据可用性
使用 R 软件（v4.0.2）以及 tidyverse、ggpubr 和 ggplot2 等软件包进行数据分析和可视化。为便于可视化，对病毒滴度进行以 10 为底的对数转换。使用单因素方差分析（1-way ANOVA）比较唾液酸结合数据，然后在 GraphPad Prism 软件（v9.1.0）中进行 Tukey 多重比较检验。由于雪貂实验的每组数量（n = 3）不足以进行可靠的统计检验，因此未进行统计检验。一些数据被排除在分析之外，包括在规定的结束时间点之前出现故障并关闭的温度应答器数据。在感染后第 3 天，未测量一只感染某株病毒的雪貂的肺重量。没有其他数据被排除在分析之外。病毒 HA 序列可从全球流感序列数据库（GISAID）获取，标识符见表 1 和图 1。支持主要图表的数据可应通讯作者的要求提供。
东莞富临医疗科技有限公司是Star-Oddi在亚洲的代理商， 为亚洲客户提供“小型传感器”与“数据记录器”公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810
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